Michaelis–Menten: K_m pelo gráfico de Lineweaver–Burk
Enzima desconhecida. Meça a velocidade inicial v em várias [S] e determine K_m pelo ajuste linear de Lineweaver–Burk de 1/v em função de 1/[S].
Objetivo
Determinar K_m a partir de v = V_max [S] / (K_m + [S]). No gráfico de 1/v em função de 1/[S] a ordenada na origem é 1/V_max e o coeficiente angular é K_m/V_max, de modo que K_m = coeficiente angular / ordenada na origem.
Materiais
- Enzima desconhecida
- Substrato
- Ensaio de velocidade inicial
Experimento
Teoria
O gráfico de Lineweaver–Burk lineariza a cinética de Michaelis–Menten. A bancada oculta K_m, V_max e a reta de duplos recíprocos já traçada. Varia-se apenas [S]. O ensaio fornece v depois do registro. Determina-se K_m (a escala característica do substrato), não V_max.
Procedimento
- A enzima é desconhecida. Ajuste apenas a concentração de substrato [S].
- Registre. O ensaio anota a velocidade inicial v com um pequeno ruído. Não há v, K_m nem reta de Lineweaver–Burk ao vivo.
- Na tabela calculam-se 1/[S] e 1/v. Anote pontos dos dois lados da escala esperada de K_m (aproximadamente 0,5–20).
- Repita para no mínimo 6 concentrações.
- Ajuste a reta de 1/v em função de 1/[S]; K_m = coeficiente angular / ordenada na origem. Compare com o valor de referência.
Conclusão
A K_m obtida coincide com a constante oculta da enzima. As principais incertezas: ruído do ensaio e o peso dos v pequenos no gráfico de Lineweaver–Burk.