Michaelis-Menten: K_m por Lineweaver-Burk
Enzima desconocida. Mida la velocidad inicial v a varias [S] y determine K_m por la aproximación lineal de Lineweaver-Burk de 1/v frente a 1/[S].
Objetivo
Determinar K_m a partir de v = V_max [S] / (K_m + [S]). En la gráfica de 1/v frente a 1/[S] la ordenada al origen es 1/V_max y la pendiente es K_m/V_max, de modo que K_m = pendiente / ordenada al origen.
Material
- Enzima desconocida
- Sustrato
- Ensayo de velocidad inicial
Experimento
Teoría
Lineweaver-Burk linealiza Michaelis-Menten. El montaje oculta K_m, V_max y la recta de dobles recíprocos ya trazada. Se varía solo [S]. El ensayo da v después de registrar. Se determina K_m (la escala característica del sustrato), no V_max.
Procedimiento
- La enzima es desconocida. Cambie solo la concentración de sustrato [S].
- Registre. El ensayo anota la velocidad inicial v con un pequeño ruido. No hay v, K_m ni recta de Lineweaver-Burk en vivo.
- En la tabla se calculan 1/[S] y 1/v. Tome puntos a ambos lados de la escala esperada de K_m (aproximadamente 0,5–20).
- Repita para al menos 6 concentraciones.
- Compruebe la aproximación lineal de 1/v frente a 1/[S]; K_m = pendiente / ordenada al origen. Compare con el valor de referencia.
Conclusión
La K_m hallada coincide con la constante oculta de la enzima. Las principales incertidumbres: ruido del ensayo y el peso de los v pequeños en la gráfica de Lineweaver-Burk.